摘要：目的建立溃疡性结肠炎相关结肠癌（UCRCC）与NF-κB信号通路的网络模型，预测UCRCC的关键炎性靶标，明确葛根芩连汤及其指标成分组合物对这些靶标的影响。方法采用HPLC法，流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，测定10种指标成分；检索Pubmed、ScienceDirect等数据库，分别查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的上下游蛋白，采用Cytoscape软件，预测UCRCC的关键炎性靶标；在AOM/DSS诱导的UCRCC小鼠模型中，通过免疫组化、ELISA方法明确葛根芩连汤及其指标成分组合物对关键炎性靶标的影响。结果葛根芩连汤中葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的含量分别为1.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.μg/g。交互网络中综合排名较高的前8位炎症因子分别是NF-κBp65、iNOS、COX-2、Bcl-2、TNF-α、IL-1β、ICAM-1和VCAM-1。与模型组比较，葛根芩连汤低、中、高剂量组及其指标成分组合物组、美沙拉秦肠溶片（5-ASA）组均显著下调UCRCC模型小鼠结肠组织中NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达（P＜0.01），并显著降低血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平（P＜0.05、0.01）。结论葛根芩连汤及其指标成分组合物能够改善UCRCC小鼠结肠组织病理情况，并下调炎性因子的表达，对UCRCC具有一定的干预作用，为确定葛根芩连汤质量标志物（Q-marker）奠定了基础。

作为反映中药安全性和有效性的质量控制新模式，基于刘昌孝院士提出“中药质量标志物（Q-marker）”的新概念[1-4]，国内外学者对元胡止痛滴丸、脑心通胶囊、双黄连制剂等进行了大量探索[5-9]。Q-marker是与中药的功能属性密切相关的化学物质，“有效性”是该研究模式中的关键因素之一。

葛根芩连汤具有轻清解肌、清热止利的功效，用于治疗太阳表邪内陷所致肠热下利证，现代药理学研究表明葛根芩连汤及其药效物质在解热、镇痛、抗炎、免疫、止泻、抗菌等方面均有良好的作用[10-12]。溃疡性结肠炎相关结肠癌（ulcerativecolitisrelatedcoloncancer,UCRCC）是溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）背景下高发的结肠癌，是UC患者的重要死亡原因[13-15]。目前，众多学者认为UCRCC的发病机制与UC病程、炎症严重程度呈正相关[16-17]。研究表明NF-κB通路是桥连UC和UCRCC关键。同时，课题组前期已经揭示葛根芩连汤及其药效物质主要通过阻断NF-κB通路治疗UC的重要机制[18-19]，故推测葛根芩连汤也可能通过调控NF-κB通路干预UCRCC。本实验旨在研究葛根芩连汤及其指标成分组合物对UCRCC的影响，而其中关键问题是如何从众多指标成分中，有针对性地筛选Q-markers。

1仪器与材料

1.1仪器

Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Adventurer电子天平（美国OHAUS公司）；Cytoscape（3.6.1）软件；MULTISKANMK3全自动多功能酶标仪（美国Thermo公司）；RM病理切片机（德国徕卡公司）；DHA电热恒温培养箱（美国OHAUS公司）；Nikon倒置显微镜及成像系统（日本尼康公司）；AnkeTDL80-2C离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2药材

葛根、黄芩、黄连、炙甘草购买自哈尔滨市道外区三棵树药材市场，经哈尔滨商业大学杨玉山工程师鉴定分别为豆科植物野葛Puerarialobate(Willd.)Ohwi的干燥根、唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根、毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎。

1.3药品与试剂

葛根素（批号）、大豆苷（批号）、黄芩苷（批号）、黄芩素（批号）、汉黄芩素（批号）、盐酸小檗碱（批号）、盐酸巴马汀（批号）、盐酸药根碱（批号）、甘草酸（批号）、甘草苷（批号）对照品购于四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数均≥98%；乙腈（色谱纯，批号）（FisherScitific公司）；氧化偶氮甲烷（AOM，批号A，美国Sigma公司）；葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子质量～，批号，美国MPbiomedical公司）；美沙拉秦肠溶片（5-ASA，批号H，黑龙江天宏药业股份有限公司）；ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒（北京中科万邦生物科技有限公司）；指标成分组合物由提取物按测定比例组成：葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、盐酸巴马汀提取物（宝鸡市润宇生物科技有限公司）、大豆苷提取物（天津中新药业有限公司）、甘草苷提取物（富生制药有限公司）、盐酸药根碱、汉黄芩素提取物（四川省维克奇生物科技有限公司）。

1.4动物

清洁级BALB/c小鼠，雌性，8周龄，体质量（20±2）g，购买自长春市亿斯实验动物技术有限公司，许可证号SCXK--。动物饲养于室温20～25℃，相对湿度45%～70%的环境下，自由饮食饮水。

2方法与结果

2.1葛根芩连汤化学成分分析

2.1.1色谱条件AgilentC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10min，15%乙腈；10～25min，30%～40%乙腈；25～40min，40%～80%乙腈；40～50min，80%～%乙腈；50～55min，%～15%乙腈；柱温30℃；体积流量0.8mL/min；进样量10μL。在此色谱条件下，检测波长为nm时指认出10个色谱峰，如图1所示。

2.1.2对照品溶液的制备取葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、甘草苷、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇配制成质量浓度为1.20、1.05、1.08、1.15、1.04、0.96、0.99、1.13、0.98、1.06mg/mL的对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备参照《中国药典》年版对葛根、黄芩、黄连、炙甘草各饮片进行鉴定。取葛根8g、黄芩3g、黄连3g、炙甘草2g，加入10倍量水，浸泡30min。先煎葛根，水沸后煎煮20min，再和余药共煎至30min，滤过，残渣加入10倍量水，水沸后再煎20min，趁热滤过；合并两次滤液，浓缩，冷至常温，加水调整至药材质量浓度为0.1g/mL。

2.1.4阴性样品溶液的制备按供试品溶液制备方法，分别制备缺葛根、缺炙甘草、缺黄芩、缺黄连的阴性样品溶液。

2.1.5方法学验证

（1）线性关系考察：分别精密量取对照品溶液，加甲醇稀释，摇匀，得系列混合对照品，进样测定各成分峰面积。以峰面积积分值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行线性回归。结果见表1，各成分在质量浓度范围内线性关系良好。

（2）精密度试验：精密量取混合对照品溶液，连续进样5次测定，记录色谱图。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.75%、0.62%、1.10%、1.03%、1.05%、0.98%、0.67%、0.92%、1.08%、1.25%。

（3）稳定性试验：精密量取混合对照品溶液，分别于0、2、4、8、12h进样，记录色谱图。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.78%、0.98%、1.36%、1.08%、0.96%、0.88%、1.02%、1.13%、0.10%、0.85%。

（4）重复性试验：制备3份供试品溶液，进样测定，记录色谱图。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.95%、0.96%、1.15%、1.36%、%、1.05%、1.18%、1.65%、1.83%。

（5）加样回收率试验：精密量取已知各成分含量的样品3份，每份1mL，精密加入对照品，制备供试品溶液，进样测定，并计算回收率。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸的加样回收率分别为.05%、.20%、.08%、99.21%、97.92%、.37%、99.92%、99.66%、99.84%、99.97%，RSD值分别为0.%、0.87%、1.69%、1.96%、1.65%、0.88%、1.73%、1.77%、0.93%、0.42%。

（6）含量测定：制备3批葛根芩连汤，每批平行测定3次，进样测定峰面积，计算各批次各成分含量，结果表明葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的质量分数分别为1.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.μg/g，RSD值分别为1.45%、0.21%、0.31%、0.15%、2.48%、0.26%、0.25%、0.10%、0.31%、0.06%。

2.2建立UCRCC疾病与NF-κB通路的交互网络模型筛选关键炎症因子

通过Pubmed、ScienceDirect、WebofScience、CNKI等关键数据库，分别查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的上下游蛋白，采用Cytoscape软件分别将NF-κB与UCRCC的上下游蛋白作为起点和终点，所建立NF-κB通路与UCRCC的交互作用网络如图2所示，依据Betweenness和Degree两项指标，推测NF-κB与UCRCC交互作用的关键蛋白，其中综合排名较高的前8位炎症因子分别是核因子-p65（NF-κBp65）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管内皮细胞黏附分子1（VCAM-1）。以此为依据，后续实验将对以上8项指标进行测定。

2.3葛根芩连汤对关键炎症因子的影响

2.3.1葛根芩连汤的制备同“2.1.3”项下方法。

2.3.2指标成分组合物的制备按照所测定成分在复方中的比例进行组方。精密称定葛根素1.20mg、大豆苷1.05mg、黄芩苷1.08mg、黄芩素1.13mg、汉黄芩素1.04mg、盐酸小檗碱0.96mg、盐酸药根碱0.99mg、盐酸巴马汀1.15mg、甘草苷0.98mg、甘草酸1.06mg，溶于1mL甲醇中，得到指标成分组合物溶液。

2.3.3分组、造模及给药小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组，模型组，葛根芩连汤低、中、高剂量（成年人以70kg计，临床剂量为48g/d，按小鼠与人体表面积比值折算，小鼠ig给药的低、中、高剂量分别为3.12、6.23、12.46g/kg，分别相当于临床剂量的0.5、1、2倍）组，葛根芩连汤指标成分组合物组，5-ASA（临床剂量为0.58g/d，按小鼠与人体表面积比值折算，小鼠ig给药剂量为0.g/kg）组，每组8只。造模第1周，小鼠ip10mg/kgAOM（用灭菌水溶解），第2周给予含有2%DSS（用灭菌水溶解）的饮用水，自由饮用4d，而后给予正常饮用水，每日观察动物状态，称定质量，至第3周末，为第1个周期循环；第4周开始为第2个周期循环；第7周开始为第3个周期循环，制备UCRCC模型。药物以水溶解配制成相应浓度的溶液，自造模同时，分别于第2、5、8周开始，各给药组每日按剂量ig给予药物，给药体积为10mL/kg，对照组和模型组均ig等体积蒸馏水，1次/d，连续2周。最后1个周期休息10d后处死全部小鼠，取血及结肠组织[19]。

2.3.4葛根芩连汤及其指标成分组合物对UCRCC小鼠血清炎性因子水平的影响取小鼠血样，按酶联免疫试剂盒说明测定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平。结果如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤各剂量组、指标成分组合物组以及5-ASA组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。

2.3.5葛根芩连汤及其指标成分组合物对UCRCC小鼠结肠组织病理变化的影响将小鼠结肠组织于4%多聚甲醛中固定，后续脱水、石蜡包埋，连续切片，厚4μm，进行HE染色，于光学显微镜下观察各组小鼠结肠组织病理变化。结果如图3所示，对照组小鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜下血管清晰，腺体排列整齐，无溃疡形成。模型组小鼠结肠黏膜上皮脱落，腺体排列紊乱，部分腺体有大范围破坏，黏膜层内有大量炎性细胞浸润，核深染，部分核明显拉长，部分腺体排列紊乱，部分可见增生。葛根芩连汤中、高剂量组、指标成分组合物组及5-ASA组大鼠结肠黏膜上皮大部分增生修复，排列较整齐，少量炎细胞浸润。葛根芩连汤低剂量组小鼠结肠黏膜上皮有较大缺损，部分腺体增生，黏膜下层仍可见较多炎性细胞浸润。

2.3.6葛根芩连汤及其指标成分组合物对UCRCC小鼠结肠组织炎性因子水平的影响将小鼠结肠组织置于4%多聚甲醛中固定，后续脱水、包埋和切片，加兔抗抗体（按1∶稀释），4℃恒温过夜后，37℃下滴加二抗孵育30min。PBS冲洗3次，每次3min，用滤纸去除多余水分，配制新鲜AEC显色，于光学显微镜下观察。结果如图4和表3所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织中NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤低、中、高剂量组、指标成分组合物组以及5-ASA组NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。

3讨论

据统计，目前全球UC的发病率为（1～2）/万，随着UC患病率的不断上升，对UCRCC的治疗和干预日益成为该领域的热点问题[15]。其中，对非可控性炎症恶性转化的调控是重要科学问题。炎症反应在肿瘤发生、发展、恶性转化、侵袭和转移等不同阶段起决定性作用，作为枢纽中心的NF-κB则是炎症恶性转化的重要因素之一[17-18]。激活的NF-κB信号主要通过调节癌基因功能；抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖；调控肿瘤细胞周期；调控肿瘤细胞侵袭、黏附、转移、血管形成有关信号因子的表达；调控其他信号通路，使细胞去分化，产生肿瘤起始细胞等方式来影响肿瘤的发生发展。大量研究证实，NF-κB既是UC的关键途径，也是UCRCC的重要通路。通路中的多数信号因子既促进UC的发展，也参与UCRCC的发生发展[19,21-30]。Greten等的研究结果表明，UCRCC模型小鼠结肠黏膜中NF-κB表达上调，抑制NF-κB通路可明显减少结肠炎症及肿瘤的形成，IKKβ基因敲除小鼠肿瘤形成的数量也明显减少，IKK/NF-κB通路的特异性失活可减少炎症相关肿瘤的形成[31-32]。课题组前期研究表明，葛根芩连汤及其药效物质通过NF-κB信号通路干预UC，推测葛根芩连汤可能也通过该通路干预UCRCC。

近年来，中药科技工作者针对中药质量控制做了大量研究工作。随着新手段、新技术的应用，中药质量控制研究水平得到了很大提升，如建立了基于中药药效物质筛选与辨识的质量控制模式、基于体内过程的中药质控模式、基于谱效关系为指导的中药质控模式、基于生物学技术的中药质量控制思路以及基于计算机新技术的中药质控模式等。上述研究思路是中药质量控制领域的阶段性成就，对中药发展起到了良好的助推作用，但仍存在许多问题，如质控指标与中药的安全性、有效性关联性不强，有效性指标如何选择，研究思路、方法如何有效整合等[33-34]。随着Q-marker的提出，出现了整合多种研究思路的“基于中药质量标志物的质控模式”，为中药质量控制提出了新的研究模式与思路，有利于建立中药全程质量控制体系。中药质量标志物是指存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质，可作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制；而不是经过生物体内过程被吸收的化学物质和所产生的化学物质，需要经过结构分析确定其化学结构，并可进行定性定量的特有的化学成分。中药质量标志物的基本条件是中药材和中药产品中固有存在的或加工制备过程中形成的化学物质，与中药功能属性密切相关，即有效性和可控性[6]。因此，本研究
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