偶氮还原酶（AzoR）是一种必需的还原酶，与肠道疾病如溃疡性结肠炎（UC）密切相关。为了获得有效的治疗，研究UC的发生和发展非常重要。UC的主要发病机理是对肠道细菌的异常免疫反应，这将引起AzoR水平的动态波动。因此，开发用于在UC诊断和治疗过程中原位监测AzoR活性变化的分析方法非常重要。用于检测AzoR活性的传统方法是基于偶氮染料（例如甲基红）生物还原后的颜色变化的生色测定。同时，荧光方法由于其明确的时空分辨率，高灵敏度和出色的选择性而成为研究的重点。迄今为止，仅成功构建了几种用于检测细菌或细胞中AzoR活性的荧光探针。设计用于体内原位监测AzoR的荧光探针仍然具有挑战性。
本文作者设计并合成了基于半菁的近红外（NIR）荧光探针（Cy-Azo），作者选择半花菁作为荧光团，选择偶氮基作为反应位点。探针本身是非荧光的。在添加AzoR后，偶氮基团被还原并且强NIR荧光信号被释放（方案1）。
如图1所示，Cy-Azo本身的最大吸收带集中在nm处。加入AzoR后，在nm处的吸收带明显减少，在nm处出现新的吸收带并逐渐增加。接着，作者对酶催化Cy-Azo与AzoR的反应进行了荧光滴定实验，Cy-Azo对AzoR活性显示出高灵敏度，荧光增强了17倍，并且对AzoR的选择性超过其他酶，离子和氨基酸。Cy-Azo对溶液中的AzoR具有很高的灵敏度和选择性，因此可用于可视化活细胞和细菌中AzoR的活性。探针的发射位于NIR区域的nm处，这有利于其在体内的应用。作者通过测量具有各种AzoR活性的Cy-Azo的时间依赖性荧光强度，以评估探针的响应速度，结果显示在20min便达到稳定。作者还研究了pH，温度等对Cy-Azo荧光反应的影响，结果表明，在约pH7.4，37℃下，Cy-Azo对AzoR的荧光变化最大。这对于在生理条件下应用探针是有利的。
同时，作者提出了一种可能的响应机制：Cy-NH2由氨基供体(推)和半氰胺受体(拉)组成，使ICT过程从供体到受体发生，并构建一个推-拉系统，使荧光开启。Cy-Azo中的偶氮基团被AzoR还原并裂解，产生Cy-NH2)并经HPLC，MS和理论计算证实（图2）。
此外，基于低细胞毒性，作者将Cy-Azo成功应用于可视化两种细胞系（HCT和HepG2细胞）和三种细菌（(E.coli（大肠杆菌），S.aureus（金黄色葡萄球菌）和P.aeruginosa（铜绿假单胞菌）)中的AzoR活性（图3和图4）。
活体原位成像是精确监测疾病的有力工具。作者研究了近红外探针(Cy-Azo)成像UC小鼠AzoR活性的潜力（图5）。所有小鼠腹腔注射Cy–Azo，分别进行荧光成像。作者还做了结肠荧光成像，小鼠血液荧光成像等，这些实验结果验证了荧光成像的准确性。由于其NIR发射，该探针可以监测急性和慢性UC小鼠模型中的AzoR活性。这是第一种在体内检测AzoR活性的荧光探针，可为UC的诊断和治疗提供重要信息。综上所述，Cy-Azo在UC的诊断和治疗中可以作为监测AzoR活性的有力工具。
DOI:10./acs.analchem.9b
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